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沙眼衣原体的实验室的检测方法

更新时间:2020-01-11 11:49:29  推荐指数:

  沙眼衣原体的实验室检查包括病原学方法和非病原学方法。病原学方法包括衣原体直接镜检、衣原体培养、衣原体抗原检测( 免疫层析法、酶联免疫法和直接免疫荧光法)、衣原体核酸检测(包括核酸探针杂交和PCR);非病原学方法包括衣原体抗体检测(用 衣原体抗原检测血中特异的衣原体抗体)、组织病理和尿白细胞计数。本篇内容主要介绍标本直接检查。

沙眼衣原体的实验室的检测方法

  一、直接显微镜检查

  1、Giemsa染色或碘染色

  Giemsa染色或碘染色临床标本的衣原体直接镜检C.t可在敏感细胞中增殖,在细胞中形成包涵体。用拭子搽落或白金耳刮落含有 包涵体的黏膜细胞直接涂片,做Giemsa染色或碘染色,如发现有一定数量的具有特征性的包涵体则可作出诊断。

  此法简便易行,但仅适用于新生儿眼结膜炎刮片的检查,对泌尿生殖道沙眼衣原体感染的诊断不够敏感,一般不直接应用于临 床标本的检测。

  2、直接免疫荧光试验(DIF)

  已有15种血清型的衣原体主要外膜蛋白制成单克隆抗体,并用荧光素做标记。当标本中存在衣原体时,针对沙眼衣原体主要外 膜蛋白或脂多糖的单克隆抗体与相应的抗原结合,单克隆抗体标有荧光素,在荧光显微镜下,阳性者可见到亮苹果绿的原体和始体。

  此法诊断沙眼衣原体感染的敏感性为70%~90%,特异性为83%~99%。30~40分钟即可出结果。标本的贮存和运送方便,标本中 的沙眼衣原体不必是存活的或是有感染性的。由于已经有商品化的试剂盒供应,方便了使用。因而有些实验室将它和衣原体培养并列为 扩大的“金标准”。缺点是在低感染率的人群中敏感性差,受实验人员的主观影响大。

  它最适宜用来检测沙眼衣原体高流行率人群(如性病门诊患者)。

  二、酶联免疫吸附试验

  先将处理过的固相载体(微孔或珠子)和标本一起孵育,如标本中含有衣原体,即可吸附于固相载体上。把未结合的物质洗去 后,再将固相载体与抗衣原体抗体结合,然后再加入含有辣根过氧化物酶的抗体(二抗),二抗能与固相载体上的抗原抗体复合物发生 反应。然后再加入底物和邻苯二胺溶液,酶能将其氧化成桔黄色,颜色的深浅和抗原的量成正比,颜色可用酶标仪测出,当标本的吸收 值大于或等于阈值时则视标本中含有C.t。

  此法的一个显著优点是自动化程度高,可同时检测大批量标本,敏感性较高(67%~90%),特异性强(92%~97%),阳性预期 值基本可靠(32%~87%)。用仪器判定结果,结果较为客观。

  最适宜用来检测沙眼衣原体高流行率人群。在低流行率的人群中应用时,解释结果宜慎重。

  三、胶体金免疫沉淀法 该法是将附有衣原体单抗的乳胶颗粒(胶体金)复合物吸附于滤纸上,将滤纸夹在两块塑料板中间。如加入的标本中含有衣原体抗原, 则标本中的抗原与结合有乳胶(胶体金)的单抗结合。复合物由于毛细作用向前扩散移动,在结果窗中与二抗结合作用出现一条红线, 标本即为阳性。

  本试验敏感性为87%,特异性为98.8%。试验方法简单,出结果快。但敏感性较差,标本需要有一定量的抗原,抗原含量低时可 出现假阴性。

  四、分子生物学方法 近年来,随着分子生物学的飞速发展,许多分子生物学诊断方法相继出现,核酸杂交(核酸印迹法、斑点印迹法和组织原位杂交法等) 特别是核酸扩增试验已不断用于衣原体的诊断。

  1、核酸杂交

  核酸杂交是最早用于衣原体诊断的分子生物学方法,其基本原理是具有一定同源性的二条核酸单链在一定条件下(适当的温度 和离子浓度等)按碱基互补的原则形成双链。杂交过程高度特异,杂交的双方是探针和待检核酸,待检核酸是衣原体特异的基因或质粒 DNA,探针用放射性同位素或非放射性物质标记,以利于信号的检测。根据C.t染色体和质粒的DNA序列设计DNA探针。

  目前已有诊断衣原体的商品化探针试剂盒,它是利用标记有荧光素吖啶橙的单链 DNA 来检测靶衣原体中的rDNA。当形成一定的 RNA-DNA复合物后,通过化学发光仪读出结果,敏感性和特异性分别为70%~92%和97%~98%。

  2、核酸扩增

  核酸扩增试验是继核酸杂交试验之后又一个重要的检测手段。试验通过对特定对象(靶DNA)的扩增放大,使检测的敏感性大大 提高。

  目前使用最广泛的是聚合酶链反应(PCR)。测定衣原体DNA,敏感性80%~92%,特异性99%(男性患者尿道标本和生殖道标本无 差别,女性尿道标本的敏感性较阴道标本低)。用于诊断沙眼衣原体感染的PCR法已有商品化试剂盒。

  PCR法诊断泌尿生殖道沙眼衣原体感染的敏感性高,在细胞培养阴性者亦能检测出沙眼衣原体感染。一种PCR(以质粒DNA顺序为 引物)阳性而培养阴性的标本可以用另一种PCR(以不同的质粒DNA顺序或主要外膜蛋白基因顺序为引物)证实,说明可能并非是PCR假 阳性结果。然而,也有报告由于“残留”污染而造成PCR假阳性,或因标本中含有Taq酶抑制物质而使PCR呈假阴性。在PCR反应体系中加 入内参照可以发现假阴性问题,此时可将标本以反复冻融几次或冻存较长时间或稀释等方法来解决。

  临床上,PCR的结果应该结合病史和治疗情况进行分析,必要时重复取材或在另一部位取材作试验。沙眼衣原体核酸扩增技术的 另一进展是可用清晨首次尿(或禁尿4小时后的首次尿)作为标本。美国2015年性传播疾病诊疗指南中,沙眼衣原体的诊断唯一提到的 方法就是NAATs,并且提到了清晨首次尿同样可以用于沙眼衣原体感染的诊断。由于尿液取材方便,对患者无侵害,因此这种方法适合 于在不同人群中进行大规模筛查,也适合于边远地区标本采集后运送至中心实验室进行检测。

  PCR检测技术在衣原体感染中的应用前景是:C.t 泌尿生殖道感染的早期诊断,尤其适用于无症状携带者或轻症患者的诊断;做 衣原体感染的分子流行病学调查,为性传播疾病的监测提供依据。

沙眼衣原体检测试剂
沙眼衣原体检测试剂

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